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由Albrecht,H Denardo,G L; Denardo,SJ Pretargeted放射免疫疗法(RIT)是增加恶性实体瘤RIT治疗指数的一种有前景的方法。对于上皮癌的预靶向RIT,如乳腺和前列腺,粘蛋白1(MUC1),上皮粘蛋白被选为靶抗原(Ag)过度表达,低糖基化和细胞膜上顶端分布的丧失将肿瘤相关MUC1与正常MUC1区分开来MUC1的这些特征,在乳腺癌中最为人所知,在前列腺癌中得到验证正在开发的多价双特异性MUC1预靶向分子包括肿瘤结合模块和放射性半抗原捕获模块的结构选择每个模块的结构单元作为单链抗体片段(scFv),与选自抗MUC1文库的scFv共价连接到多功能聚乙二醇(PEG)支架聚乙二醇化研究中并且用游离硫醇工程化以进行位点特异性缀合,显示出最高的反应用短单功能PEG分子获得离子产率为了适应双功能PEG用于结合和捕获模块的共价组装,MUC1结合模块被开发成di-scFv-SH形式并针对游离子的长度和位置进行了优化。关于Ag结合和位点特异性结合的硫醇研究中用双功能PEG分子改善PEG化产率的方法包括烷基 - 叠氮化物环加成通过PEG化,结合和捕获模块的组装效率和药代动力学将影响MUC1预靶向的最终效价分子:抗-MUC1 di-scFv-PEG-抗放射性半抗原scFv或di-scFv-PEG-抗放射性半抗原di-scFv关键词:药物标记 - 乳腺肿瘤 - 前列腺肿瘤虽然第一次放射免疫疗法(BIT)实验是在20世纪50年代早期用含有骨肉瘤异种移植物的大鼠进行了^ sup 131 ^ I标记的兔抗血清,1临床意义随着抗体的使用,随着Kohler等人在1975年开发出的杂交瘤技术的发展,生产克数量的单个表位的纯鼠单克隆抗体(MAb)的能力极大地促进了抗体的使用并有助于鉴定肿瘤相关抗原(TAA)的细胞毒性放射性剂量的靶向递送使用系统递送的MAb,称为RIT,在20世纪80年代作为一种新型和有希望的癌症疗法出现在放射性标记的MAb在成像研究中的早期临床应用之后, 3 RIT在癌症治疗中的疗效已在动物模型和患者中得到广泛研究4-5这些试验提出了RIT的两个主要局限性:1)在一些患者中,针对小鼠来源的MAb发展免疫应答,已知作为人类抗小鼠抗体;和2)正常组织辐射毒性,特别是骨髓,由于放射性标记的MAb的长循环时间,小鼠来源的MAb引发的免疫应答被它们用嵌合,人源化和完全人抗体以及重组体的取代所绕过。抗体片段这是通过分子免疫学的进步和过多的分子生物学技术的发展和适应基因工程抗体而成为可能的。肽噬菌体展示技术的适应性展示单链(sc)Fva6是重组抗体的重大突破技术噬菌体展示的能力以及随后开发的展示技术,在于它们提供表型和基因型之间的直接联系。这极大地促进了针对给定抗原(Ag)的抗体片段的选择和克隆目前使用两种途径用于产生人抗体:克隆人Fv fra免疫球蛋白(Ig)的人类恒定区域的免疫和工程化表达人IgG的转基因小鼠的免疫7 RTT治疗非霍奇金淋巴瘤的功效已经获得美国食品和药物管理局批准的两种放射性标记的抗CD20 MAb: Zevalin([90Y] ibritumomab)(Idee Pharmaceuticals,San Diego,CA,USA)和Bexxar([^ Ittositumomab)(Corixa,Seattle,WA,USA) 与实体瘤相比,放射性标记的抗体必须渗透到组织中,血液系统恶性肿瘤可以更好地接触放射性标记的抗体,对肿瘤细胞更具放射敏感性。因此,输送到肿瘤的放射性剂量大于正常组织/器官所接受的放射性剂量。并且导致高治疗指数(TO,定义为对肿瘤的放射性除以对正常组织的放射性因此,成功的实体瘤RIT需要更高的TI一些策略,包括靶向抗体的药代动力学优化,8个可切割的连接子为实现这一目标,已经设计了9种联合模式RIT10最有希望的方法之一是预靶向,其中靶向抗体的药代动力学通过单独的注射与放射性核素的药代动力学分离.11大大增强的TI已经在动物模型中显示出来患者为两个广泛研究的预靶向系统: 1)抗体片段 - 链霉抗生物素蛋白(SA)融合蛋白与放射性标记的生物素; 2)双特异性抗靶标Ag和抗放射性半抗原抗体12,13基于SA /生物素的系统的优点有两个:1)通过SA四聚化实现对靶Ag的高功能亲和力; 2)生物素对SA的高亲和力提供了对放射性核素的有效捕获。然而,SA及其类似物是免疫原性的双特异性抗体,另一方面,人源化或人类,已经开发出各种形式,大小和价值,14-15有助于优化其药代动力学模块化设计似乎是克服多价双特异性抗体低产量的良好策略。在这里,我们报告了开发用于转移性乳腺癌和前列腺癌RUC的模块化多价双特异性预靶向分子的实验路径MUC1作为靶抗原粘蛋白1(MUC1),也称为多形性上皮粘蛋白,多态性尿粘蛋白,表唾素质,DF3Ag,上皮膜抗原和CA15-3,是以大分子量(MW)为代表的粘蛋白家族的成员。糖蛋白根据其基因序列,粘蛋白分为两组:分泌型或跨膜粘蛋白MUC1基因编码odes一种跨膜粘蛋白,其特征在于存在3个结构域:细胞外,跨膜和细胞质16除遗传外,MUC1多态性通过可变剪接在信使核糖核酸(mRNA)水平上产生,在蛋白质水平通过糖基化MUC1产生,最初合成为单一N末端亚基由细胞外结构域组成,由可变数目(20-100)的20个氨基酸重复序列(VNTR)18组成.VNTR基序,GVTSAPDTRPAPGSTAPDAH,可携带多达5个Oglycosyl由于丝氨酸和苏氨酸残基是O-糖基化的靶标,因此MUC1 C末端亚基由短的细胞外区段和随后的跨膜结构域和细胞质尾部16组成.MUC1 N和C末端亚基的二聚化导致束缚于细胞膜上。大的MUC1细胞外结构域17(图1)其棒状结构在细胞表面上方延伸超过100-200nm超过大多数膜蛋白长度的5至10倍19在正常腺体组织中,MUC1作为高度糖基化的蛋白质在正常分泌性上皮细胞的顶端边界上表达20相反,在肿瘤组织中,MUC1过表达并且低糖基化,由于腺体结构的丧失,MUC1表达不再局限于上皮细胞的顶端边界21(图1)肿瘤相关MUC1实现了理想TAA的许多特征:22它几乎在所有人类上皮细胞上表达腺癌(乳腺癌,胰腺癌,卵巢癌,肺癌,膀胱癌,前列腺癌和子宫内膜癌)占人类肿瘤的近80%; TAA MUC1不同于正常细胞上存在的MUC1; TAA MUC1比正常MUC1更丰富前列腺癌中靶抗原的评估低糖基化MUC1表位(较少O-聚糖)的表达在乳腺癌中得到最好的记录,与正常组织相比,用抗MUC1 MAb识别出更多的染色。低糖基化形式的MUC123-24并非所有癌症都表达高水平的低糖基化MUC1表位,并且癌症进展并不总是与这种MUC1形式相关25,26在原发性前列腺癌中,基因表达谱分析显示可以区分3种癌症亚型,并且MUC1在两种中表达。最具侵袭性的亚型27在原发性和转移性前列腺癌组织中基因表达的比较中未报道MUC1基因的差异表达.28正常和恶性前列腺上皮细胞中MUC1的检测具有识别细胞质表位的MAb,导致MUC1表达异质的结论然而,通过使用特异于唾液酸化MUC13的MAb [度]观察唾液酸化MUC1水平与前列腺癌的组织学分级和临床分期之间的相关性。在比较正常,原发性和转移性前列腺的反应性的研究中具有与低糖基化MUC1结合的MAb的癌组织增加在较高等级的前列腺癌中发现MUC1表位和低糖基化的MUC1形式31为了更好地了解前列腺癌中MUC1的表达,进行了MUC1细胞外结构域的表位作图,但与之前使用一个或两个MAb的研究不同,使用7个充分表征的抗MUC1 MAb免疫组织化学(IHC),在正常和前列腺癌组织上进行,随着微阵列上存在的Gleason等级增加,显示随着Gleason等级增加,MUC1表位和MUC1的低糖基化形式增加(图2)32 IHC数据还显示,大多数(但不是全部)前列腺癌样本均为MUC1阳性,与之前的研究结果一致27- 3i因此,根据我们的数据和其他人的数据,* 1针对低聚糖基化形式的MUC1进行成像和预靶向侵袭性前列腺癌的RIT是合适的图1-正常和异常粘蛋白的特征1(MUC1)MUC1蛋白表达的示意图上皮来源的正常和恶性细胞1:MUC1蛋白的细胞外结构域,具有可变数目串联重复基序的丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基的O-糖基化注意异常MUC1上的低糖基化; 2:MUC1蛋白的跨膜结构域;和3:MUC1蛋白的细胞质结构域图2-用抗粘蛋白1(MUC1)单链抗体片段(scFvs)对前列腺组织的免疫组织化学(IHC)两种抗MUC1 scFv和两种充分表征的抗MUC1鼠单克隆抗体(MAbs)的反应性)(BrE3识别中等和低糖基化的MUC1和B2729上的TRP表位优先与高糖基化/正常MUC1反应)通过EHC测试,在正常至良性(A),前列腺上皮内和Gleason 1至2级(B)和Gleason 3至5级(C)前列腺组织核心(06 mm)抗MUC1 scFvs的选择已经产生了针对Ags的许多抗MUC1 MAb,包括人乳脂肪球(HMFG),肿瘤细胞膜,肽和寡糖。反应性的研究和56个MAb对MUC1糖蛋白的特异性导致以下结论:34个MAb定义了位于VNTR基序内的表位; 16个单克隆抗体显示出碳水化合物残基参与其表位的证据;免疫原的类型与每种抗体的特异性之间没有明显的关系; PDTRPAP的亲水序列总是部分或全部存在于MUC蛋白核心内的表位中。肽表位中PDTRPAP序列的存在与通过核磁共振鉴定的每个MUC1 VNTR基序中的免疫显性肽区域一致。被称为“PDTR”旋钮34另一种针对HMFG产生并与TRP表位35反应的抗MUC1 MAb BrE3已用于乳腺癌患者的成像和RIT36。基于该信息,选择含有4个VNTR的MUC1肽作为用于制备超免疫抗MUC1 scFv噬菌体展示文库的Ag噬菌体展示文库的scFv形式的选择受到以下事实的指导:单价25-30KD scFv作为用于工程化多价靶向分子的合适模块出现。使用RPAS小鼠scFv构建了两个抗MUC1 scFv噬菌体展示文库。模块(Amersham Biosciences Corp.,Piscataway,NJ,USA)和从BALB / c或NZB免疫小鼠的脾脏中提取的mRNA(来自MUC1表达MCF7和HBT 3344肿瘤细胞的细胞膜富集的裂解物,比例为10:1,然后以3周的间隔进行3次注射)最初的BALB / c scFv噬菌体文库含有107个克隆,估计多样性为10538.用RPAS小鼠scFv模块克隆Igs的VH和VL结构域导致插入相应的DNA序列将VH-VL方向的scFv与(G ^ sub 4 ^ S)^ sub 3 ^肽接头连接到pCANTAB 5E表达载体中(图3)从该载体表达的ScFv携带用于周质输出的N末端信号肽和C通过免疫亲和层析纯化的末端E标签通过3轮亲和选择选择抗MUC1 scFv,其中减少量(100,50和10nM)与生物素化的牛血清白蛋白缀合的MUC1肽并用磁性SA涂层捕获珠子在ELISA测定中进行进一步选择,其中scFv含有单个克隆的周质提取物,与MUC1合成肽结合的ScFv和MCF7(人乳腺癌)和DU145(人前列腺癌)细胞的裂解物进行DNA测序。序列分析显示选择的抗MUC1 scFvs在氨基酸水平上具有70%或更高的序列同源性从周质提取物中纯化的可溶性scFv的产量从01 mg / L到15 mg / L不等。这些scFv的亲和力常数与MUC1的结合通过Scatchard确定的肽和线性回归在17×10 ^ sup 8 ^和82×10 ^ sup 8 ^ M ^ sup -1 ^ 39之间。这种scFv结合亲和力对于靶向与实体瘤相关的Ags是令人满意的,因为已知阈值亲和力需要10 ^ sup 7 ^ - 10 ^ sup 8 ^ M ^ sup -1 ^来观察^ sup 125 ^ I-scFv肿瘤摄取,并且观察到肿瘤积累没有增加,亲和力高于10 ^ sup 9 ^ M ^ sup -1 ^ 40 In半胱氨酸用于位点特异性聚乙二醇化scFv模块与支架如PEG的连接可以是随机的或位点特异性通过随机靶向赖氨酸残基的伯胺或通过使用2亚氨基四氢噻吩引入的游离硫醇的结合是令人满意的大分子,如抗体对于较小的蛋白质和肽,随机偶联通常会导致生物活性的降低或丧失41此外,随机偶联也会产生异质的最终产物,这对于药物来说是不合需要的质量另一方面,在特定位点的偶联,远离分子的活性位点,限制对生物活性的干扰并导致均一的结合物基于硫醇化学的位点特异性结合似乎适用于scFv,原因如下:大多数scFv缺乏游离硫醇和在两者之间形成的域内二硫键。存在于每个VH和VL结构域中的2个半胱氨酸被完全掩埋通过插入DNA诱变,可以通过在任何选定位置插入半胱氨酸来提供游离巯基因为我们感兴趣的是将游离巯基添加到超过1 scFv,表达载体的修饰似乎更合适。因此,N和C scFv的末端仍然是插入半胱氨酸的唯一两个可能位置。通过3D建模证实,存在于未结构化的亲水性N和C末端的scFv中,39支持scFv末端的游离SH的可接近性。 ,scFv C末端作为更好的选择出现,因为它已经含有额外的E Tag序列,并且具有C末端半胱氨酸插入的其他scFv具有保留的活性43-45通过PCR定向诱变将半胱氨酸指定密码子(TGT)添加至pCANTAB 5E载体骨架,用于scFv克隆的Sfil / NotI限制性位点的下游和用于通过亲和层析进行scFv纯化的E标签序列的上游(图3);此版本的pCANTAB 5E,设计用于向其表达的任何scFv添加C末端半胱氨酸,命名为pCANTAB 5E Cys46与未经修饰的scFv相比,从细菌周质提取物中纯化的可溶性scFv cys摇瓶中的产量通常为减少了一半,而他们的Ag结合活性增加了两倍 scFv cys泄漏到培养基中的趋势解释了它们的产量降低和它们改善的Ag结合活性反映了由共价scFv同型二聚体或(scFv')2的形成导致的增加的功能亲和力。在没有还原的情况下tris(2-羧乙基)膦(TCEP),scFv cys的单体和二聚体以大致相似的比例共存45,46 scFv cys的双重形式中的每一种都有应用在没有还原剂的情况下,scFv-SS具有增强的Ag结合活性的-scFv二聚体对Ag结合测定提供更高的灵敏度;这对于免疫组织化学特别有用46对于位点特异性缀合,通过添加还原剂将二聚体转化为scFv-SH单体可获得100%的游离硫醇。图3 - 多价开发中涉及的步骤的示意图预靶向分子MUC1结合模块的形式:共价和二价di-scFvs scFv cys模块在双功能PEG支架上的位点特异性缀合的初始尝试满足45%(scFv)^ sub 2 ^ -PEG产物位点特异性PEG化其他人也报道了单官能PEG的产率高达80%48除了聚乙二醇化产率随着每个PEG分子的官能团数量的增加而减少,均相多官能PEG的合成也很困难。因此,尽管理论上有吸引力,但3的多聚化也是如此。通过PEG化的4个scFv cys模块在实践中仍然难以实现自药代动力学和最佳肿瘤Ag结合的考虑有助于MUC1预靶向分子的原始设计,其设计只能在构建模块方面改变,但不能改变作用方式。换句话说,MUC1预靶向分子应保持MW> 70 KD以规避肾小球滤过并提供二价结合以获得对靶向肿瘤Ag的功能亲和力因此,代替scFv cys模块和trior四官能化PEG,修改肿瘤结合模块的形式以适应双功能PEG的使用(图3)最受欢迎的二价scFv形式是双抗体,通过缩短长度获得的非共价二聚体(图4-抗粘蛋白1(MUC1)双单链抗体片段(scFv)-SH和di-scFv-PEG A的免疫反应性)免疫反应性通过免疫组织化学(IHC)对表达MUC1的乳腺(MCF7)和前列腺(DU145)癌细胞测试的抗-MUC1 di-scFv-SH(D5c5D5)B)测试的抗-MUC1 di-scFv-PEG缀合物(D5c5D5-PEG)的免疫反应性通过IHC对MUC1表达唱歌乳腺癌(MCF7)和前列腺癌(DU145)与MUC1阴性对照MAb相比(Lym-1与HLA-DR决定簇反应)条形代表20 mm抗-MUC1 di-scFvs的免疫反应性抗体的免疫反应性在体外和体内评估所选形式的MUC1 scFv(scFv-G ^ sub 4 ^ SC-(G ^ sub 4 ^ S)^ sub 3 ^ -scFv)用于di-scFv-SH模块体外结合在ELISA中证实MUC1肽和表达MUC1的细胞的裂解物,并且IHC实验显示di-scFv-SH(D5c5D5)与表达MUC1的肿瘤细胞的膜结合(图4A)。对于体内肿瘤结合评估,di-scFv-将SH(D5c5D5)与[niIn] DOTA-马来酰亚胺缀合,将纯化的[111In] DOTA-D5c5D5缀合物(表观分子量为52KD)注射到其腹壁上携带双侧皮下DU145肿瘤异种移植物的小鼠中。肿瘤靶向为通过γ相机成像可视化(图5)在体外T评估聚乙二醇化MUC1结合模块的免疫反应性将抗-MUC1 di-scFv-SH(D5c5D5)用5KD线性双功能(甲氧基和马来酰亚胺活性基团)PEG聚乙二醇化,并通过凝胶排阻色谱法纯化的di-scFv-PEG产物测试其MUC1结合活性。用MUC1肽,MCF7和DU145细胞裂解物作为Ags的ELISA测定显示,di-scFv-PEG的免疫反应性与di-scFv-SH(非PEG化的对应物)的免疫反应性相当。该结果通过IHC对MUC1的证实。表达肿瘤细胞(图4A,B)图5-用抗粘蛋白1(MUC1)双链抗体片段(scFv)进行体内肿瘤成像DU145肿瘤异种移植物γ相机图像箭头指向[111n] DOTA-anti -MUC1 di-scFv-SH(D5c5D5)通过双侧植入裸鼠腹壁的肿瘤摄取,如尾静脉注射后1天可视化 最佳可视化的DU145肿瘤异种移植物尺寸小于(约250mg)坏死肿瘤,在注射后24小时几乎未检测到。强肾和膀胱摄取也可视化讨论选择靶向MUC1肽表位,由MUC1细胞外结构域的VNTR携带,通过在上皮癌如乳腺癌和前列腺癌中存在丰富的低糖基化MUC1形式来证明32,56 MUC1预靶向分子的组装用于转移性乳腺癌和前列腺癌的成像和预靶向RIT需要三个主要组成部分:肿瘤Ag结合模块,放射性半抗原捕获模块和双功能PEG,用于共价连接结合和捕获模块MUC1结合模块,开发为di-scFv-SH并针对scFv-G ^ sub 4进行了优化^ SC-(G ^ sub 4 ^ S)^ sub 3 ^ -scFv,具有52KD的表观MW并且可以使用放射性半抗原捕获模块,由抗DOTA(放射性)组成。金属)scFv,已经开发出两种形式:scFv-SH和di-scFv-SH虽然MUC1预靶向分子的设计明确地设定为与肿瘤Ags的二价结合,但放射性半抗原的捕获将是单价或二价的。 scFv-SH或di-scFv-SH捕获模块之间的选择理想地基于双特异性(scFv)2亚基-PEG-scFv和(scFv)2亚基-PEG-(scFv)的体内性能。 sub 2 ^ MUC1预靶向分子由亲水性大体积PEG产生的空间位阻,其解释了PEG缀合物的众所周知的益处,例如降低的免疫原性,增加的半衰期和溶解度以及蛋白酶抗性,还通过降低蛋白质可接近性来限制PEG化产率。因为应该通过使用较短的PEG分子来减少空间位阻,所以MUC1预靶向分子中的PEG支架的大小不应超过10KD因此,对于(scFv)^ sub,这样的分子的MW将是75-85KD。对于(scFv)^ su,2 ^ -PEG-scFv和100-110KD b 2 ^ -PEG-(scFv)^ sub 2 ^并且在任何一种情况下足够大以防止通过肾小球过滤从循环中快速消除正在研究提高scFv-SH和di-scFv-SH模块的PEG化效率的各种方法这种方法包括使用1,2,3三唑结扎(“点击化学”)共价连接到结合和捕获模块的双功能(叠氮化物/三炔)PEG支架这种方法已经产生高达74%的scFv- PEG-scFv分子并提供对产物组成的控制58因为较小分子与双功能和小尺寸PEG的连接更有效,增加(scFv)^ sub 2 ^ -PEG-scFv分子的组装产率的可能性是高于(scFv)^ sub 2 ^ -PEG-(scFv)^ sub 2 ^分子另一方面,(scFv)^ sub 2 ^ -PEG-(scFv)^ sub 2 ^的显着产量提高可能通过使用双功能短PEG,例如具有双特异性的2KD PEG-Mal ^ sub 2,实现nti-MUC1和抗放射性半抗原,di-scFv-SH对于MUC1预靶向分子的放射性核素捕获模块而言,效价优于MW以获得优异的肿瘤保留59这一事实可能并不重要,这表明要实现的目标,TI用双特异性三价或四价预靶向分子可以实现RIT的改善最近,癌胚抗原预靶向分子,作为通过对接和锁定方法组装的双特异性三价Fab构建体,在人结肠癌模型中显示出高度的肿瘤定位60总之,用于转移性乳腺癌和前列腺癌RIT的MUC1预靶向分子的临床前开发处于最后阶段结合和捕获模块的PEG化效率将影响这些分子的最终效价:双特异性,三价或四价scFvs在第18次IRIST会议上的介绍,伦敦,2006年7月12 - 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